Molecular genetikoa ikerketa metodoa

arakatu eta aldaerak identifikatzea DNA egitura erabili molekularreko metodoa genetikoan. DNA eskualde bakoitzean, eta horrek kromosoma, gene edo alelo eskualde honetan arakatzen lortzeko, metodo desberdinak. molekularreko Metodo genetikoak bakoitzaren azpian osatuta batzuk edo beste RNA eta DNA manipulazioa. Metodo horiek guztiak dira konplexutasun izugarria ezaugarri, gabe laborategiko baldintza ezin da gauzatu, eta langileek goi mailako prestakuntza izan behar dute. Lan hau egiten da, hainbat fasetan.

faseak

Lehenik eta behin, RNA edo DNA laginak ekoiztu ahal izateko. Hemen, metodo genetikoak molekularra ia material edozein aplika daiteke: odola, leukozitoak tanta bat, fibroblastoetan kultura, mukosa (scraped), nahiz eta ile-folikuluetan, - DNA edozein lagin lor daiteke. egokia edozein molekularreko metodoak genetikoa eta bere aukera ezberdinak erabili da eta ez dute DNA luze isolatu gordetzen den izoztuak. Bigarren etapa da, nahi den zatiak (anplifikazioa) DNA metaketa eskainia, bermatzeko polimerasaren kate erreakzioa vitro (in vitro organismo bizi inplikazioa gabe) laguntzen baitu. Ondorioz, hautatutako DNA zatien biderkatzen kate-erreakzio honen arabera, eta DNA handitzen literalki milioika aldiz zenbatekoa.

molekularreko ikerketa genetikoaren metodo hirugarren pausoa biderkatu DNA murrizketa (zatiketa hau, urraketaren edo ebaketa) suposatzen da. Murrizketa landuko elektroforesi bidez polyacrylamide edo agarosa orrian. DNA zati ikasten metodo molekularren-genetikoa honi esker, denek gel zenbait posizio bat hartzeko. Hortik aurrera, gel ethidium bromuro tratatu, DNA loteslea gai, argi ultramoreekin irradiazio, orduan posible da luminescence zatiak behatzeko. Molecular genetikoa diagnostiko metodo anitz eta ugari daude, baina lehen bi urrats guztietan komunak dira. Baina horretarako DNA zatiak identifikatzeko, gel koloretako daiteke, eta askotan existitzen diren bestelako metodoak.

espezie

detektatzeko mycobacteria for zuzenena eta hedatuago metodoak gainetik molekularreko DNA genetikoa ikaskuntza metodoa daitezke. Bere funtsa da ordena eskaneatu katean patogeno DNA zatiak zehatzen materiala identifikatzea, hori. Molecular genetikoa diagnosi-teknikak oraindik ez dute modu eraginkorragoa gaixotasunak, hala nola tuberkulosia gisa aitortu. the polimerasaren kate erreakzioa (PCR) erabiliz, ziur jatorrizko DNA hori kopia-kopurua handitu egingo milioi bat aldiz ere, hau da, ez dago anplifikazioa izango da, eta emaitzak erakutsiko dira izan dezakezu. laurogeita bost puntu, zein metodo honen abantaila nagusia da baino gehiago - sentikortasun maila oso altua da.

Ikerketa metodoak molekularreko-genetikoa etekin anitz kopiak eraginkortasuna Gainerako literalki bikoiztu geroztik kasu honetan idazteko lagina erakusten oligonucleotide sekuentzia zehatz bat, ehun eta sei aldiz igo da. Nahiz eta kultura Arnas sistemako tuberkulosia diagnostikatzeko nabarmen jaistea bere sentikortasuna. Horregatik medikuntza modernoaren da molekularreko tuberkulosia diagnostikatzeko metodo genetikoak oinarritzen da. azaldutako metodo eraginkorra da batez ere, antigeno aldakortasun handiko patogeno aurre, beste era horretan zehaztuko askoz zailagoa da - berezia eskatzen elikagai media eta denbora luzez lantzen. Biokimika eta molekularreko teknika genetikoak sortzen emaitzak eragina oso desberdina.

tuberkulosia diagnostikoa

Marshall PCR tuberkulosia diagnostikatzeko gehien DNA sekuentziak horiek lau gaixotasunaren mota guztietako dagozkio erabiliz. Helburu hori lortzeko, askotan erabili antzemateko sekuentzia DA elementuak (DA-986, DA-6110) primers, elementu horiek ezaugarritu gisa oso migratzaile espezie Mycobacterium tuberculosis eta beti genoma dauden anitz kopiak. Era DNA erauzketa egin daiteke kulturen hutsa eta klinikoa (gaixoen sputum) beste edozein metodo egokiak by from. Adibidez, Boom metodoa non lisi bufferraren oinarritutako guanidine thiocyanate eta silize garraiolari DNA gisa erabiltzen da. Paziente kaskarra bakteriologikoak urtero handituz datoz, eta, beraz, praktika kliniko antolaketetako guztiz desberdinak ezarri ditu kopuruak: DNA aztertzen metodo molekularren-genetikoa izan diagnostikoa garrantzitsua jolasten.

Hala ere, aitortu behar dugu ez dela desabantaila gabe. PCR metodoa da askotan erabileraren emaitzak faltsuak positiboz kopuru handi bat dakar, eta arrazoia ez da soilik, akats teknikoak, baina baita metodoaren beraren ezaugarriak. Horrez gain, diagnostikoa metodo hau erabiltzen mycobacteria, eta horrek izan dira identifikatu bideragarritasuna zehazteko, besterik gabe, ezinezkoa da. Baina desabantaila hori ez da garrantzitsuena. Molecular PCR diagnostiko metodo genetikoak ekarriko mikobakteriano DNA kutsadura arriskua. Ziurtagiria horregatik eskakizun hori diseinatu esklusiboki hard PCR laborategietan, hiru lokaletan bereizi behar dira. PCR teknologia modernoa eta oso konplexua da, ekipo egokia eta goi-trebatutako langileen erabilera eskatzen du.

bacterioscopy

Noiz diagnostikoa analisiaren emaitzak beste datuekin konparatuta behar dute: azterketa klinikoak, erradiografia, Lohitu mikroskopia, laborantza eta are tratamendu jakin bati erantzunez oso garrantzitsuak dira. Serie honetan, PCR ikasketak baino ez da osagai bat. Detektatu patogenoa diagnostiko hasieran errazena eta azkarrena metodoak izan daiteke - bakteriologikoak.

Ez dago argi mikroskopio bat (kolore Ziehl-Neelsen) eta fluoreszenteak (kolore fluorochromes) erabiltzen da. Abantaila abiadura emaitzak Lohitu da. Baina bere eragozpen asmatu jotzen da edukiera mugatua dela eta sentikortasun txikia. Hala ere, metodo hau ematen da OMEren gomendioa merke eta lurrera tuberkulosia gaixoen detektatzeko gisa. mycobacteria bakteriologikoak metodoa hautematea iragarpen balioa eta estimatzen kuantitatiboki bakterien iraizketa ditu. Askoz gehiago ziur da molekularreko genetikoa ikerketa tuberkulosia metodoak aurre.

kulturen

mycobacteria detektatzeko hobea ikasketa kulturalak ezagutzea. material patologikoak Erein da arrautza ertain sartu dute: Mordovsky, Finn II, LJ, eta antzekoak. vitro sendagaiak eta zeharkako mycobacteria kopuru baten eraginkortasuna froga eta beren kolonia mycobacteria erresistentzia eredu, ikerketa kulturako metodoa aplikatzen bada. mycobacteria material patologikoa galarazteko isolamendua ehunekoa da ingurune anitz ospatzen handitzea.

kultura, patogeno barne beka eta fluidoen ugari beharrak asetzeko. Sistema hau erabiltzen da, eta automatikoki neurketa mota VANTES hazkundea. Laborantza izango inkubazio ospatu behar zazpi-zortzi aste da. Une honetan hazkunde eza batera uzta har daiteke negatiboa. The Mycobacterium tuberculosis detektatzeko modurik eraginkorrena kontuan lagin biologikoak: diagnostiko material kutsatuko Cobaya, oso TB jasan.

zifra batzuk

ezkutuko infekzio - ikasketa eremu interesgarriak, zela inauguratu bertan PCR diagnosia arabera M. tuberculosis aztertzeko zen. TB infekzioa kontzeptu modernoa iradokitzen duten M. tuberculosis kontaktuan zeuden ehun pertsona out, laurogeita ondo kutsatuta egon, baina horietako hamar baino ez dira gaixotasunak aktiboa garatzen ari da. Beste batzuk izan TB immunitatea, eta kasuen ehuneko laurogeita delako infekzioa ezkutuan geratzen. Detektatu eredu bat metodoa genetiko molekularra lagundu du.

Genetistek esan berrogeita hamabost eguneko direnentzat laboreak patologikoa material negatiboak izan ziren, eta M. tuberculosis kutsatuta pertsonen ehuneko laurogei, baina gaixotasunaren agerpen radiographic gabe isurtzen ehuneko, PCR erantzun positiboa jaso duela. ziren negatiboa genetikoa diagnostiko metodo bat lagundu gaixoen identifikatzeko arriskua PCR ikasketak arabera, beren analisietan (mikroskopia eta kultura) emaitzekin da, eta subclinical infekzio M. tuberculosis present izan zen.

ikerketa modernoak

nitrato reductase Griess erreaktiboarena probatu mycobacteria of jarduera: Errusiako Federazioan eta bakteriologikoak laborategiak kontzentrazio absolutua metodo azkarra eragin erabili. Anti-TB-guneak ahalbidetzen duen droga erresistentzia zehazteko metodo bat erabili. media likido aletzen hau, non automatizatu erradiometriko eta kontabilitate fluoreszente sistemaren mycobacteria hazkundea. Horrelako analisi bat azkar egiten da - bi aste.

Gaur egun, metodo berriak garatzen ari dira: droga mycobacteria erresistentzia genotipo mailan neurtzen da. erresistentzia geneen mekanismoak molekula eta azterlana mycobacteria presentzia erakusten. Gene horiek drogak zenbait erresistentzia lotutako. Adibidez, Kasa geneak, inhA lortzeko, katG isoniazid, rpoB gene aurrean erresistentzia - rifampicin 16Sp RNA geneak eta rpsL - streptomycin, emb1 - ethambutol, Gyra to - fluoroquinolone eta abar.

mutazio

diagnostikoa moderno nabarmen handitu molekularreko-genetikoaren mailako metodoa DNA aztertzeko eta eskala handiko mutazio ikasketak burutzeko euren espektro guztietan onartzen. Orain badakigu 516, 526 eta 531 codons mutazio ohikoenak rpoB geneak, eta hori identifikatu hainbat droga erresistentzia. Ez dago mycobacteria metodo tradizionalak ez bakarrik erabiliz Idazteko metodo sorta oso bat da - biokimikoa, biologiko eta kulturala, baina baita oso zabaldua molekularreko teknika genetikoak modernoak erabiltzen. Dagoeneko badaude egokia eta zuzena diagnostikoa gaixotasun monogenikoaren detektatzeko metodoa ematen. Dute DNA gene jakin baten inguruan zehatza ikasketak oinarritzen dira. Hau izan ohi da prozesu konplexua da, denbora kontsumitzen eta garestia da, baina hori molekularreko azterketa genetikoa emandako datuen, beste analisi guztien datuak baino askoz zehatzagoak eta informazio.

aspalditik ezagutzen da gero hori DNA ez du organismoa dela edozein nucleated zelula odnakova ere bizitza osoa aldatuko, eta horregatik, erabat gorputzaren zelula guztien analisi hartu posible da, edozein ontogenia etapa. kaltetuta gene beharreko lehenengo sintomak itxura eskala full-gaixotasunak klinikoa da, baita heterozigotikoa pertsona osasuntsu aurretik detektatu daiteke, baina gene batean mutazio bat izatea. Molecular genetikoaren herentziazko gaixotasun diagnosi metodoak bere (zuzeneko hurbilketa, DNA-diagnóstico) erakusteko, baita gaixotasunaren bereizketa aztertzeko markatzailea loci DNA (aldaera genetikoen), hau hurbiletik kaltetuta gene bat (hau da, zeharkako DNA-diagnóstico hurbiltzean) lotuta daude elkarrekin familian onartzeko. Zuzenean edo zeharka - Edozein DNA diagnostiko zorrozki definitua giza DNA zati bat identifikatuz metodoak oinarritzen da.

zuzeneko metodoak

DNA diagnostikoa metodoak Zuzeneko denean erruduna gene herentziazko gaixotasuna da ezaguna, baita ezagunak dira, eta horren mutazio motak. Adibidez, gaixotasun kopuru bat ere egokia metodoak zuzeneko. Hau Huntington-en chorea (luzapena ctg-errepikatzen), Fenilzetonuria (R408W), fibrosi kistikoa (delF508, mutazioak nagusia) eta antzekoak. zuzeneko metodoa abantaila nagusia osorik jabetzako diagnostiko zehaztasuna bat da, eta ez dago DNA familiako gainerako azterketa bat egin behar da. dagokion gene mutazio bat aurkitzen badu, zehazki aukera ematen onestea herentzia, genotipo determinazio diagnostiko bat du zama familiaren osorako.

diagnostikoa zuzeneko beste abantaila hartzen da senide eta gurasoengandik mutazio txarra duten gaixotasunaren hil garraiolari heterozigotikoa bat identifikatzeko. Hori bereziki egia for gaixotasun autosomiko. metodoak zuzeneko desabantailak ere eskuragarri daude. Horietako aplikatzeko, zehazki jakin anormal gene, exon-intron bere espektro eta bere mutazioak egitura kokatzeko behar duzu. monogenikoaren gaixotasun guztiak gaur Not informazio hori jaso dute. Informativeness zuzeneko metodoak ezin dira bete, eta gene bera delako patologikoa mutazio ugari gaixotasun hereditario garatzea eragiten duen izan dezake.

zeharkako metodoak

DNA diagnostiko zeharkako metodo guztietan erabiltzen dira, beste kasu batzuetan, bada kaltetutako gene ez da identifikatu, baina bakarrik chromosomally, edo line diagnostikoa ez zuen emaitza eman (gertatzen da, eta gene antolakuntza molekularra konplexua edo neurri handi, asko badira bada mutazio patologikoen). Zeharkako metodoak landuko bereizketa polimorfikoak markatzaileak azterketa alelikoa familia batean. the kromosomikoak bereko eskualde edo locus aurkitu markatzaileak oso lotuta dago gaixotasuna lotuta eta zirriborro edo insertions, puntua ordezkapenak, errepikatzen ordezkatzen, eta haien polymorphism blokean zelula-kopuru ezberdinak direla eta.

Gehienak zeharkako diagnostikoa jotzen mikrosatelitearen eta minisatellite polimorfismoak, eta hori oso giza genoma banatzen erosoa. beren balioa informazio-eduki adierazten da, markatzailea eta gene arteko distantzia genetikoa kalteak ez da handiegia bada. Azken kasu horretan, estimazioa zehaztasuna da polimorfikoak markatzailea eta kalteak arteko birkonbinazio-maiztasuna neurri handi batean zehaztu. Falta diagnosi metodoak, gainera, derrigorrezko aurretiazko alelo aztertu biztanleria gaixoen eta mutazio-eramaile artean ikasketa maiztasunak urratsa, gehi nonequilibrium eta atxikidura markatzaileak eta aldakor aleloen birkonbinazio probabilitatea zehazteko beharra ematen.

beste metodo

RNA edo DNA segmentu Short, baita gene bakar azterketa mikroskopikoa azpian bistaratzen ezin izango da, beraz, beharrezko molekularreko diagnostiko genetikoa arabera mutazioak identifikatzeko. Ez dago "Giza Genoma Proiektua", baita beste genetika molekularreko aurrerapenak da asko zabaldu gaixotasun hereditario diagnostikoa egiteko aukera - bai aurreko eta jaio ondorengo. Metodo horiek goiz detektatzeko eman dezake eta iragarpena poly- eta monogenikoaren gaixotasun, zeinen debuta gertatzen heldutasunera egiteko. Zoritxarrez, molekularreko ikasketak genetikoa gaitasun teknikoak direla eta, batzuetan, etiko mugak direla herentzia erlazionatu ere kanpo daude, batez ere, diagnostikoa nerabezaroan eta haurtzaroan da.

Egitura-eta zenbakizko kromosomikoak anomaliak gaixotasunak eta minbizia, eta malformazioak askoren kausa ohikoena dira. Chromosomal aberrazioak identifikatu behar dira, hau da, familia aholkularitza garrantzitsua - Iragarpen ebaluatzeko, etorkizuneko haurdunaldiak ugalketa arriskua batera. Kromosoma analisi "gold standard" diagnosi genetikoa da, baina mugatua da. metodoak Bakarrik molekularreko analisi genetiko gehiago egin daiteke, ez erabili euren sentsibilitate handiko gai teknologia oinarritutako fluoreszente labels klonazioa ezinezkoa klasikoa detektatu dira sotil kromosomikoak aldaketak identifikatzeko delako zitogenetikoan ikasketak. Teknika hauek gero eta gehiago dira gure diagnostiko gaitasunak zabalduz, noiz aztertu, desarrollista ezintasunen, adimen-atzerapena, beste hainbat herentziazko gaixotasunak dituzten haurrak.

aurkikuntza

Oso garrantzitsua gizadiarentzat du gene egitura eta ezagutza funtzioa, aldakortasun mota, gaixotasun hereditarioa dela genetika molekularreko garapenari lotuta gertatu detektatzeko gaitasuna izan ziren da. Bere metodoak dira DNA molekularen ikerketaren zuzenduta - eta normala denean, eta noiz hondatuta dago. azido deoxyribonucleic nukleotido (DNA) sekuentziak prestatzea fasetan zabaltzen banakako zatiak identifikatzeko laginak jasotzen. zelulak DNA genomikoaren, murrizketa (tearing), anplifikazioa (klonazioa), elektroforesi zatien isolamendua (bere karga elektrikoa eta pisu molekular bereizten agarosa arabera). banda diskretu baten azalean kokatzen zatiak zehatzen identifikazioa.

Ondoren, egintza iragazkiak bereziak, horren bidez klonatu DNA zatiak edo sintetikoa zundak erradioaktiboa batekin pasarte hibridazio bakoitza pasatzen sartzeko kontrol bat egiten proba lagin bakoitzaren berdina izango da. posizioa edo luzera aldatzen duzunean aldean zunda batera badu, bada pasarte berri bat edo desagertu - hori guztia dioen aztertu gene hori nukleotido sekuentzia berregituratzea jasan du. Badira molekularreko ikasketak genetikoa oinarrizko zortzi teknikak: sekuentziazioa (DNA sekuentzia determinazio), polimerasaren kate erreakzioa (sekuentzia kopuruaren igoera), primers ezagutzen geneak prestatzeko, DNA klonazioa, molekula errekonbinanteak ekoizteko eratorritako proteinak molekula errekonbinanteak ondorioz, multzo osoa bat sortuz (bilduma liburutegia) klonatu dela murrizketarik erabiliz lortu ziren zatiak.